Молекулярно-генетический анализ

Молекулярно-генетический анализ
  • Секвенирование генома;
  • Целевое секвенирование (экзомы и панели: Agilent SureSelect; Ампликоны);
  • Секвенирование методом RAD;
  • РНК-секвенирование;
  • Метагеномное секвенирование.

Предлагаемые центром PRADUS диагностические панели, разработаны институтом CeGat, ведущим специалистом в области молекулярно-генетического анализа в Европе.

Генетикам института CeGat, первым в мире, удалось объединить генетическую диагностику и высокопроизводительное секвенирование (high-throughput sequencing) в новый метод анализа генетического материала. В 2010 году CeGat создал «Панельную Диагностику» (Diagnostic Panels), позволяющую в рамках одного исследования расшифровывать, анализировать и интерпретировать все те гены, которые содержат информацию относительно одного конкретного заболевания.

С момента своего создания CeGat использует технологию «Секвенирования Нового Поколения» (Next-Generation Sequencing, NGS). В зависимости от поставленной задачи и клинических целей исследования, секвенирование производится на платформах Illumina HiSeq и MiSeq. При этом процесс преобразования ДНК в секвенцию можно разделить на три этапа:

1. Создание ДНК-библиотеки.
Для создания ДНК-библиотеки дезоксирибонуклеиновая кислота сперва подвергается фрагментации. По окончанию фрагментации концы ДНК-фрагментов восстанавливаются, т. к. в процессе фрагментации они могут «растрепаться». Заключительным этапом создания ДНК-библиотеки является лигатура стыковочных элементов с обеих сторон восстановленных ДНК-фрагментов. Эти стыковочные элементы содержат мотивы последовательности, необходимые для следующих этапов NGS.

2. Клональная параллельная амплификация.
Технология Illumina использует для клональной амплификации отдельных фрагментов ДНК-библиотеки так называемые Bridge-PCR (твердофазная полимеразная цепная реакция). Эта полимеразная цепная реакция проводится на базе Flow Cell (предметное стекло с объектодержателем), на котором и происходит секвенирование. Для этого фрагменты ДНК через адаптеры стыкуются с Flow Cell, после чего проводится Bridge-PCR, в рамках которой олигонуклеотиды выступают в качестве праймера. В рамках этой амплификации для каждого фрагмента ДНК возникают отдельные кластеры клональных фрагментов ДНК.

3. Секвенирование.
Метод секвенирования синтезом (Sequencing-by-Synthesis, SBS) технологии Illumina использует Cyclic Reversible Termination (CRT). Все четыре нуклеотида ассоциированы с разными красителями и модифицированы терминаторной группой. В рамках реакционного цикла все четыре нуклеотида посредством действия полемиразы подвергаются синтезу. Все четыре красителя каждого нуклеотида фиксируются при помощи интроскопии: краситель и терминаторная группа расщепляются и начинается новый цикл. Таким образом, на базе Flow Cell образовывается секвенция каждого кластера основа за основной. При помощи компьютера формируются отдельные reads («прочтения») и сопоставляются с референтным геномом.