Molekulargenetische Analyse

Molekulargenetische Analyse
  • Genom Sequenzierung
  • Targeted Sequencing (Exom und Panels: Agilent SureSelect; Amplikons)
  • Restriction site associated DNA Sequencing (RAD genotyping)
  • RNA Sequenzierung (Transkriptom Sequenzierung, Small RNA Sequenzierung)
  • Metagenom Sequenzierung

Die vom PRADUS angebotenen diagnostischen Panels wurden vom CeGat Institut entwickelt, einem führenden Experten auf dem Gebiet der molekulargenetischen Analyse in Europa.

Den Genetikern des CeGat Instituts ist es als Wegbereitern gelungen, genetische Diagnostik und Hochdurchsatz-Sequenzierung zu einer neuen Methode der genetischen Materialanalyse zu kombinieren. Im Jahr 2010 hat CeGat diagnostische Panels entwickelt, die es ermöglichen, alle Gene, die Informationen über bestimmte Krankheiten enthalten, zu entschlüsseln, zu analysieren und zu interpretieren.

CeGat verwendet seit seiner Gründung die Technologie „Next-Generation Sequencing“ (NGS). Ausgehend von der Aufgabe und klinischen Zielen der Untersuchung wird die Sequenzierung auf den Plattformen Illumina HiSeq und MiSeq durchgeführt. Der Prozess der DNA-Transformation in eine Sequenz lässt sich in 3 Stufen aufteilen:

1. Herstellung einer DNA-Bibliothek
Zur Herstellung der DNA-Bibliothek muss die DNA zunächst fragmentiert werden. Die Enden der DNA-Fragmente werden repariert, da sie durch die Fragmentierung beschädigt werden können. Das letzte Stadium der Herstellung der DNA-Bibliothek ist die Ligation von Adaptern an beide Seiten. Diese Adapter enthalten Sequenzmotive, die für weitere Schritte benötigt werden.

2. Klonale Amplifikation
Die Illumina-Technologie nutzt die sogenannte „Bridge-PCR“ zur klonalen Amplifikation einzelner DNA-Fragmente. Diese PCR wird an der Flow Cell (einer Glasseite ähnlich einem Objektträger) durchgeführt, auf der die eigentliche Sequenzierung stattfindet. DNA-Fragmente werden über die Adapter mit der Flow Cell verbunden, dann wird die Bridge-PCR durchgeführt und Oligonukleotidefungieren dabei als Primer. Innerhalb dieser Amplifikation bildet jedes einzelne DNA-Fragment eine separate Gruppe identischer DNA-Fragmente.

3. Sequenzierung
Sequenzierungsmethode von Illumina Sequencing-by-Synthesis (SBS) basiert auf der CRT-Methode (Cyclic Reversible Termination). Jedes der vier Nukleotide ist mit einem anderen Farbstoff verknüpft und durch eine Terminatorgruppe modifiziert. Während eines Reaktionszyklus werden alle vier Nukleotide gleichzeitig zur Polymerase der Strangsynthese ausgesetzt. Die vier Farbstoffe jedes Nucleotids können unter Introskopie nachgewiesen werden: der Farbstoff und die Terminatorgruppe werden gespalten und ein neuer Synthesezyklus beginnt. Die Sequenz jedes Clusters wird somit gleichzeitig Basis für Basis bestimmt. Die einzelnen „reads“ („Lesesätze“ ) werden gebildet und mit dem Referenzgenom verglichen.